Цитогенетичне дослідження мезенхімальних стовбурових клітин із пуповини щурів, культивованих in vitro

Оксана Михайлівна Загричук; Ілона Русланівна Палій; Аліна Іванівна Довгалюк; С.Б. Крамар; Галина Йосипівна Лавренчук

Резюме. Результати преклінічних наукових досліджень та клінічних випробувань свідчать про високу ефективність використання стовбурових клітин для відновлення уражених патологією структур організму. Важливою умовою отримання високоякісного клітинного матеріалу для регенеративної медицини є підтримання цитогенетичної стабільності культури стовбурових клітин in vitro. Мета дослідження – цитогенетично проаналізувати культуру клітин пуповинних канатиків ембріонів щурів на різних пасажах культивування та оцінити стабільність каріотипу культивованих стовбурових клітин. Матеріали і методи. Для отримання мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) використовували пуповинні канатики щурів лінії WISTAR Rattus norvegicus Berkenhout. Аналіз проводили протягом 1–8 пасажів. Метафазні пластинки отримували за модифікованою стандартною методикою каріотипування. Після тригодинного інкубування у 10-7 М розчині колхіцину, здійснювали трипсинізацію матеріалу. Далі фермент нейтралізували кондиційним середовищем і до клітин додавали теплий гіпотонічний розчин KCl (0,075 М). Матеріал фіксували оцтовим метанолом (1:3) на танучому льоді. Фіксатор замінювали тричі, потім суспензію клітин розкапували на холодні вологі предметні скельця. Зразки фарбували розчином Романовського – Гімзи. Цитогенетичний аналіз МСК проводили на 30 метафазних пластинках на кожному пасажі. В отриманих зразках виявляли кількісні порушення хромосомного набору (анеуплоїдію (АП), поліплоїдію (ПП)) та підраховували кількість клітин з мікроядрами (МЯ), мітотичний індекс (МІ). Частоту прояву АП, ПП та МЯ вираховували на 500 клітин (у %). Результати. При дослідженні МСК пуповини щурів вже на перших пасажах виявлено поодинокі порушення в хромосомному наборі, такі, як АП та ПП. Кількість клітин із цитогенетичними аномаліями поступово зростала із збільшенням тривалості культивування, однак відсоток клітин з нормальним каріотипом не зменшився до восьмого пасажу більше ніж на 10 %. Відсоток АП на перших двох пасажах зростав від 1,5 до 1,9 %. При подальшому культивуванні до 6 пасажу рівень АП зріс майже в 3 рази. За два наступних пасажі кількість АП майже не змінилася. На перших двох пасажах відсоток ПП був мінімальний – 1,1–1,3 %. До шостого пасажу відзначали підвищення кількості таких клітин у 2,8 %. При культивуванні до восьмого пасажу подвоєння числа хромосом зросло ще в 1,1 раза. У першому пасажі в культурі МСК був зареєстрований дуже малий відсоток МЯ (≈0,2 %). При продовженні пасажування їхня кількість зросла на 2,9 %. Мітотичний індекс МСК зростав з першого до п’ятого пасажу з 3,9 до 4,8 %. З кожним наступним пасажем мітотичний потенціал клітин знижувався і до завершення аналізованого періоду культивування становив 3,1 %. Висновки. Аналіз каріотипу клітин пуповини щурів за підібраних умов культивування показав незначне зростання відсотка АП та ПП. Також спостерігали низький відсоток клітин з мікроядрами. Отже, на ранніх пасажах дану клітинну лінію можна безпечно використовувати з терапевтичною метою для лікування змодельованих патологій у щурів

мезенхімальні стовбурові клітини, цитогенетичне дослідження, анеуплоїдія, поліплоїдія

[1] Chromosomal stability of mesenchymal stromal cells during in vitro culture / B. G. Stultz, K. McGinnis, E. E. Thompson [et al.] // Сytotherapy. – 2016. – Vol. 18, No. 23. – P. 336–343.

[2] Liver injury associated with acute respiratory distress syndrome and the prospects of mesenchymal stromal cells therapy for liver failure / O. Redko, A. Dovgalyuk, A. Dovbush [et al.] // Cell and Organ Transplantology. – 2021. – Vol. 9, No. 2. – P. 136–142.

[3] Яцишина А. П. Генетична нестабільність клітин ссавців in vitro / А. П. Яцишина // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. – 2010. – No 8. – С. 165–178.

[4] Сравнительный цитогенетический анализ стромальных клеток костного мозга на различных пассажах у крыс линии WISTAR / Е. А. Омельченко, В. Е. Кульшин, Е. С. Зарубенко [и др.] // Проблеми безперервної медичної освіти та науки. – 2011. – No 4. – С. 55–59.

[5] Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies / F. Casiraghi, G. Remuzzi, M. Abbate [et al.] // Stem Cell Rev. – 2013. – Vol. 9. – P. 65–79.

[6] Мазуркевич А. Й. Цитогенетичний аналіз культу-ри клітин жирової тканини щурів на ранніх пасажах / А. Й. Мазуркевич, В. В. Ковпак, О. С. Ковпак // Український часопис ветеринарних наук. – 2017. – No 265. – С. 159–167.

[7] Визначення умов виділення первинного матеріалу та культивування мезенхімальних стовбурових клітин щурів / О.М. Загричук, А.І. Довгалюк, Г.Й. Лавренчук [та ін.] // Всеукраїнська науково-практична конференція з міжнародною участю «Сучасні питання молекулярно-біохімічних досліджень та лабораторного скринінгу у клінічній та експериментальній медицині – 2020», 05–06 березня 2020 р. – Запоріжжя, 2020. – С. 8–9.

[8] Фрешни Р. Я. Культура животных клеток : практическое руководство / Р. Я. Фрешни. – БИНОМ : Лаборатория знаний. – 2010. – 691 с.

[9] Arslan А. Karyotypes of the mammals of Turkey and neighbouring regions: a review / А. Arslan, J. Zima // Folia Zoologica. – 2014. – Vol. 63, No. 1. – P. 1–62.

[10] Yiğit N. The Taxonomy and Karyology of Rattus norvegicus (Berkenhout, 1769) and Rattus rattus (Linnaeus, 1758) (Rodentia: Muridae) in Turkey / N. Yiğit, E. Çolak, M. Sözen // Tr. J. of Zoology. – 1998. – Vol. 22. – P. 203–212.

[11] Ковалева О. А. Цитогенетические аномалии в соматических клетках млекопитающих / О. А. Ковалева // Цитология и генетика. – 2008. – No 1. – С. 58–72.

[12] Long-term culture of mesenchymal stem cells impairs ATM-dependent recognition of DNA breaks and increases genetic instability / D. Hladik, I. Höfig, U. Oestreicher [et al.] // Stem Cell Research & Therapy. – 2019. – No 10. – P. 218. DOI: 10.1186/s13287-019-1334-6.

[13] Rat olfactory mucosa mesenchymal stem/stromal cells (OM-MSCs): a characterization study / R. D. Alvites, V. M. Branquinho, A. R. Caseiro [et al.] // International Journal of Cell Biology. Vol. 2020, Art. ID 2938258. – 21 p. DOI: 10.1155/2020/2938258.

[14] Ткачук Т. В. Використання мікроядерного тесту для скринінгу та моніторингу мутагенів. Історичні контролі / Т. В. Ткачук, М. Г. Проданчук // Сучасні проблеми токсикології, харчової та хімічної безпеки. – 2017. – No 3. – С. 15–25.